熒光顯微鏡是利用特定波長的光照射被檢物體產(chǎn)生熒光進(jìn)行鏡檢的顯微光學(xué)觀測(cè)技術(shù)，已有100多年歷史。近年來，由于免疫熒光在醫(yī)學(xué)研究、診斷領(lǐng)域里的廣泛應(yīng)用，F(xiàn)ISH、綠色熒光蛋白(GFP)技術(shù)分別在基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)研究方面的推廣，顯微照相、數(shù)字CCD成像技術(shù)的輔助驅(qū)動(dòng)，賦予這一傳統(tǒng)技術(shù)更新的應(yīng)用價(jià)值和生命力。

應(yīng)用要點(diǎn)

1)預(yù)檢查和調(diào)節(jié)

(1)每次進(jìn)行熒光觀測(cè)前，都要例行檢查熒光裝置的燈絲對(duì)中、光路對(duì)焦、孔徑光闌、視場(chǎng)光闌設(shè)置等狀況。

(2)所需要的熒光激發(fā)/發(fā)射濾光片組件是否已裝在轉(zhuǎn)換器中，物鏡配置是否得當(dāng)，除去物鏡前透鏡的油漬和灰塵。

(3)如同時(shí)進(jìn)行透射光相差觀察，要檢查聚光鏡對(duì)中心及相差環(huán)與物鏡相反的共軛情況。

(4)檢查樣品載體(載玻片、蓋玻片和其他器皿)有否掛有液體、灰塵，厚度是否在物鏡標(biāo)定的工作距離范圍內(nèi)。切片樣品不能太厚，約≤10μm為宜。

(5)因照明光源含有紫外線，在載物臺(tái)前上方放一塊棕色遮光板，以防紫外線損傷視網(wǎng)膜。

(6)電壓不穩(wěn)會(huì)降低高壓汞燈的使用壽命，光源電源ZUI好加配穩(wěn)壓器。

(7)為延長汞燈壽命，在開啟后15min方可關(guān)閉；汞燈熒光電源一旦關(guān)閉，再次啟動(dòng)至少需等待10min，以使水銀蒸汽冷卻復(fù)至原態(tài)，否則會(huì)影響燈的壽命。

2)熒光鏡像觀察

(1)在開啟熒光燈源后約5～10min激發(fā)光強(qiáng)度趨于穩(wěn)定，裝載樣品進(jìn)行觀察；為防止在調(diào)焦和尋找物像過程中過度激發(fā)光照會(huì)造成樣品熒光淬滅，先通過縮小熒光照明器的孔徑光闌或加ND濾光片將激發(fā)光調(diào)節(jié)到適度強(qiáng)度，有規(guī)律地移動(dòng)樣品臺(tái)，待確定鏡像后，在調(diào)節(jié)到很合適熒光狀態(tài)用于拍攝記錄。

(2)鏡像質(zhì)量不佳的調(diào)整。排除樣品制備因素外，可進(jìn)行的必要調(diào)節(jié)措施是：

①排除成像光路中的遮光或限光器件，如DIC附件、ND濾光片等。

②重新調(diào)節(jié)熒光照明器的收光器對(duì)焦和孔徑光闌大小。

③細(xì)心調(diào)節(jié)物鏡覆蓋差校正環(huán)。

④復(fù)查熒光激發(fā)/發(fā)射組件是否與所標(biāo)記的熒光色素對(duì)應(yīng)。

(3)在不影響分辨率的前提下，于照相取景框和CCD靶面范圍之外，可盡量回縮熒光光路視場(chǎng)光闌和物鏡(100X物鏡)的數(shù)值孔徑光闌調(diào)節(jié)環(huán)，以避免雜散光的影響、提高景深，并可減小激發(fā)面積防止附加樣品淬滅。

(4)暫時(shí)不觀察時(shí)，應(yīng)阻斷激發(fā)光路。

(5)油鏡觀察時(shí)，須用“無熒光油”，尤其是在U、V激發(fā)時(shí)，因常規(guī)鏡檢用的香柏油帶有青色熒光。

3)熒光照相和數(shù)字CCD相機(jī)圖像采集

(1)熒光照相

①盡管肉眼觀察熒光鏡像亮度與普通明場(chǎng)相差無幾，而實(shí)際上曝光時(shí)間要增加數(shù)倍甚至幾十倍，應(yīng)使用快速感光膠片，如ISO200(24DIN)、ISO400(27DIN)。

②根據(jù)熒光物像在測(cè)光區(qū)的分布比例和鏡像的明暗程度設(shè)置曝光補(bǔ)償調(diào)節(jié)，原則上適當(dāng)增補(bǔ)償，以獲得背景黑暗熒光圖像明亮、鮮艷的照片效果。

③如果沒有照明標(biāo)線取景器，可先選擇較明亮的熒光區(qū)域進(jìn)行對(duì)焦調(diào)整。

④對(duì)點(diǎn)狀熒光物像或撲捉某點(diǎn)為主的拍攝，可選擇適當(dāng)?shù)狞c(diǎn)測(cè)光模式。

⑤對(duì)在同一幅需要同樣條件拍攝的分散點(diǎn)狀熒光物像，可試用點(diǎn)測(cè)光配合自動(dòng)鎖定方式拍攝。

⑥曝光過程應(yīng)避免任何振動(dòng)，有條件可配置防震臺(tái)。

(2)數(shù)字CCD相機(jī)圖像采集

①光學(xué)接口的中間倍率要與CCD的芯片尺寸合理匹配。

②采用合適的熒光拍攝模式，摸索減背景(Background Subtraction)處理?xiàng)l件，根據(jù)鏡像情況設(shè)置Binning、Gain、Gamma等參數(shù)。

③因CCD芯片靈敏度較高，如果熒光鏡像過于明亮，為獲取對(duì)比度較好的采集圖像，可適當(dāng)縮小熒光照明器孔徑光闌或加ND濾光片，特別是在熒光輝光較強(qiáng)影響拍攝樣品細(xì)節(jié)的情況時(shí)。

實(shí)際工作中，為獲得較好的熒光圖像拍攝質(zhì)量需要對(duì)上述調(diào)節(jié)機(jī)制的綜合運(yùn)用，反復(fù)摸索、優(yōu)化條件。