熒光樣本制作所需材料

(一)載玻片

載玻片厚度應(yīng)在0.8～1.2mm之間，太厚的坡片，一方面光吸收多，另一方面不能使激發(fā)光在標(biāo)本上聚集。載玻片要光潔，厚度均勻，無(wú)明顯自發(fā)熒光。有時(shí)需用石英玻璃載玻片。

(二)蓋玻片

蓋玻片厚度在0.17mm左右，光潔。為了加強(qiáng)激發(fā)光，也可用干涉蓋玻片，這是一種特制的表面鍍有若干層對(duì)不同波長(zhǎng)的光起不同干涉作用的物質(zhì)(如氟化鎂)的蓋玻片，它可以使熒光順利通過(guò)，而反射激發(fā)光，這種反射的激發(fā)光可激發(fā)標(biāo)本。

(三)標(biāo)本

組織切片或其他標(biāo)本不能太厚，如太厚激發(fā)光大部分消耗在標(biāo)本下部，而物鏡直接觀察到的上部不充分激發(fā)。另外，細(xì)胞重迭或雜質(zhì)掩蓋，影響判斷。

(四)封裱劑

封裱劑常用甘油，要無(wú)自發(fā)熒光，無(wú)色透明，熒光的亮度在pH8.5～9.5時(shí)較亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和0.5mol/l pH9.0～9.5的碳酸鹽緩沖液的等量混合液作封裱劑。

(五)鏡油

一般暗視野熒光顯微鏡和用油鏡觀察標(biāo)本時(shí)，要使用鏡油，請(qǐng)使用特制的無(wú)熒光鏡油，也可用上述甘油代替，液體石蠟也可用，只是折光率較低，對(duì)圖像質(zhì)量略有影響。

熒光標(biāo)本的制作方法：

樣品須經(jīng)過(guò)石蠟包埋切片，然后用鐵礬蘇木精染色，普通光鏡觀察效果還可以作熒光觀察需用熒光染料DAPI染色，

石蠟切片的過(guò)程：

1. 取材：刀片要求鋒利而薄,組織厚度約2—3mm, 大小1.5×1.5×0.2～0.3cm為宜. 取材時(shí)間越快越好.

2. 固定: 組織取下后應(yīng)立即放入10%福爾馬林(相當(dāng)于4%甲醛)固定.

注意：(1). 固定液量應(yīng)為組織塊體積的40倍.

(2) 固定時(shí)間：固定時(shí)間與使用的固定液種類和組織塊大小, 溫度等有關(guān). 一般為3h-24h.

(3)固定溫度：大多可在室溫固定, 在低溫(4℃)時(shí)間應(yīng)延長(zhǎng).

(4)固定容器：固定容器應(yīng)大些.

3. 漂洗：流水沖洗2—10h.

4. 脫水: 從低濃度酒精到高濃度酒精.

70%(數(shù)分鐘)→80%(60-120’)→90%(60-120’)→95%(60-120’)→95%(60-120’)→****(60-120’)→****(60-120’).

5. 透明: 組織塊脫水后要經(jīng)過(guò)一種既能與酒精混合又能溶解石蠟的溶劑, 而使石蠟進(jìn)入組織塊. 常用二甲苯, 一般浸泡30m即可.

6. 浸蠟: 組織經(jīng)透明后在熔化的石蠟內(nèi)浸漬的過(guò)程稱浸蠟. 一般需經(jīng)2—3次浸漬才能完成, 總時(shí)間為3—4h. 用于浸蠟的石蠟熔點(diǎn)為52—56℃.

7. 包埋: 先將熔化的石蠟倒入包埋框再用加熱的鑷子將組織塊放入. 包埋面要平整. 包埋后石蠟稍凝后可移入冷水或冰箱中加速凝固.

8. 切片：修塊→切片→展片→撈片→烤片.也可作冰凍切片.

熒光染料的配制：

儲(chǔ)藏液：1mg/ml dapi(DMSO、去離子水、pbs都可以溶解)

工作液：通常1μg/ml

染色時(shí)須避光，10min左右

用pbs沖去多余染液即可觀察